不论是在体外感染较困难的细胞制作慢病毒文库，还是在体内进行的AAV文库，如何确定最佳剂量以确保每个靶点仅进入一个细胞，一直以来都是科研人员面临的一大挑战。文库实验的目标是寻找由单基因引发的功能变化，因此需要确保每个细胞仅被一个携带靶点的病毒感染。

在细胞实验的文库筛选中，建议首先通过对照病毒进行预实验，以探索最佳的感染倍数（MOI），通常为感染效率达到80%的MOI。文库操作中推荐的MOI为最佳MOI的三分之一，以此控制进入单个细胞的病毒数量。这种简单粗暴的削减病毒用量的方法，旨在减少重复感染的发生。然而，对于免疫细胞等难感染细胞以及体内实验，如何精确确定最佳剂量以确保靶点单独进入一个细胞依然是个难题。因为最佳MOI可能仅能达到30%的感染效率，若按三分之一的用量，则几乎无法实现细胞的感染。

尊龙凯时推出的三色荧光（mTagBFP、Venus、mCherry）病毒，可为研究人员更有效地进行文库感染预实验提供支持。该三色荧光病毒包括慢病毒和AAV两种类型，参考文献《Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq》为探索AAV文库在体内的最佳剂量提供了实验方法。为测试AAV在低感染复数下是否能够感染多个细胞，研究者进行了体内滴定实验。

研究人员准备了三种不同剂量的AAV，分别为25E9、5E9和5E10颗粒，利用phpb血清型。病毒构建方案为在CBh启动子的控制下独立表达mTagBFP、Venus和mCherry。通过流式细胞技术，研究者可以确定较低剂量以减少双病毒一起感染同一细胞的可能性，最终确定为最佳剂量，并选择了5E9颗粒的剂量，因为它能使单个AAV感染的细胞数量达到最大。

在三色实验中，研究者将三种AAV等比例混合后，注射到不同剂量的LSL-Cas9动物中（低剂量25E9、中剂量50E9、高剂量25E10）。检测结果显示，所有病毒剂量注射后，表达至少一种荧光蛋白的细胞核百分比以及分别表达1个、2个或3个荧光的感染细胞核的比率的结果十分重要。

无论是细胞实验还是动物实验，研究人员都可以利用尊龙凯时公司提供的三色荧光病毒开展相关预实验。通过设置不同的剂量梯度进行细胞感染（请参考慢病毒感染操作手册）或小鼠的体内注射（请参考动物注射文献），在不同剂量下流式分析转染效率及单荧光细胞的比例，以比较各剂量下单病毒感染比例（即单色荧光细胞数量）的结果，最终选取感染细胞数量比例最高的剂量作为最佳剂量，并作为文库的实际实验剂量。

参考文献：Santinha, AJ, Klingler, E, Kuhn, M et al. Transcriptional linkage analysis with in vivo AAV-Perturb-seq. Nature 622, 367–375 (2023).